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French to English: The new tools of microbial diagnosis of tuberculosis General field: Medical Detailed field: Medical (general)
Source text - French 2. Conduite du diagnostic direct au laboratoire
Le traitement des échantillons pour recherche de mycobactéries suit toujours le même processus en vue d’un double objectif :
• d’une part, de pratiquer un examen permettant de fournir une réponse rapide. L’examen microscopique à la recherche de BAAR est le plus courant. En fonction du contexte, d’autres méthodes pourront également être mises en œuvre ;
• d’autre part, de procéder à une mise en culture, avec des délais de réponse prolongés, qui aura pour mérite de sensibiliser le dia-gnostic mais aussi d’isoler la bactérie. Il sera alors possible de l’identifier, de mesurer sa sensibilité aux antibiotiques et éven-tuellement de procéder à des études d’ordre épidémiologique.
La manipulation des mycobactéries, en particulier celles appar-tenant au complexe tuberculosis, n’est pas dénuée de risque pour le personnel du laboratoire. Elle doit être faite dans un labora-toire convenablement équipé répondant à des critères de sécurité adéquats. Les installations de niveau de confinement 3 sont préco-nisées.
2.1. Examen microscopique
Dans la démarche diagnostique de tuberculose pulmonaire associée à des signes clinico-radiologiques, voire histologiques, l’examen direct ren-seigne sur le caractère bacillifère et donc contagieux du patient, permettant ainsi de conforter voire d’imposer l’isolement respira-toire du patient et de dépister les éventuels contacts.
Cette étape clé repose le plus souvent sur une coloration fluorescente à l’auramine, plus sensible que celle de Ziehl-Neelsen (coloration de référence) [8]. La lecture après coloration à l’auramine, requiert un microscope à lampe à mercure, supplan-tée récemment par l’utilisation de light emitting diode (LED), moins coûteuse, plus robuste et de performance identique [9]. Les BAAR apparaissent sous forme de bacilles verts fluorescents sur fond rouge pour les frottis colorés à l’auramine et rosés sur fond bleu après coloration de Ziehl-Neelsen.
Le résultat microscopique est un résultat quantitatif dénom-brant le nombre de BAAR par frottis ou par champ selon la standardisation du centers for disease control and prevention (CDC), Atlanta, USA.
Le seuil de détection microscopique est de l’ordre de 104 BAAR/mL d’échantillon. La sensibilité est variable en fonction du type de prélèvement : 10–20 % pour les prélèvements extra-pulmonaires et 65 % pour les pulmonaires [10]. De ce fait, un examen direct négatif permet d’exclure l’éventualité d’un cas bacil-lifère ou très bacillifère mais n’exclut en aucun cas le fait que le patient puisse être pauci-bacillifère et donc éventuellement contagieux. Un examen microscopique négatif n’élimine pas un
diagnostic de tuberculose. De même, il ne prédit pas une guérison dans le cadre d’un suivi de traitement antituberculeux [11].
En l’absence de clinique ou d’imagerie thoracique en faveur d’une tuberculose pulmonaire active, ou en l’absence de contact avec un sujet immunodéprimé, ou encore de notion de tuberculose multirésistante, 3 examens microscopiques négatifs permettent de lever un isolement respiratoire instauré initialement devant une suspicion de tuberculose pulmonaire [12].
L’examen microscopique positif présente lui aussi des limites. Bacilles tuberculeux et mycobactéries atypiques ne peuvent être différenciés. Par ailleurs, ne renseignant pas sur le caractère vivant ou mort des bacilles, l’examen direct positif n’est pas un bon marqueur d’efficacité thérapeutique, d’échec thérapeutique ou de rechute tuberculeuse [11,13].
2.2. Culture en milieu solide ou liquide
Bien que la croissance des mycobactéries du complexe tuber-culosis soit très lente, le diagnostic de tuberculose et la culture demeurent indissociables. Associée à une étape préalable de décontamination–fluidification pour les prélèvements provenant de cavités ouvertes, la culture reste la méthode la plus sensible. Elle permet également d’isoler la souche, support technique néces-saire à l’identification d’espèce et aux tests de sensibilité aux antituberculeux. La méthode la plus performante associe culture en milieu solide et liquide. Le seuil de détection est de 10 à 102 bacilles/mL d’échantillon biologique. Le délai de culture est fonction de la charge bactérienne et peut être corrélé aux résul-tats de l’examen direct. Les cultures en milieu solide se positivent en 2 à 6 semaines. La plupart des milieux liquides sont couplés à une détection automatique de la croissance. L’usage des automates avec incubateurs incorporés développés fin des années 1990 (mycobac-teria growth indicator tube [Bactec MGIT960® ], [Becton Dickinson], VersaTREK® [Trek Diagnostics] ou BacT/ALERT® [BioMérieux]) pré-sente l’avantage de réduire significativement le délai de positivité de 10 à 14 jours en moyenne par rapport aux cultures en milieu solide [14].
2.3. Nouvelles méthodes antigéniques par immunochromatographie
Il existe deux types de tests immunochromatographiques pour recherche du complexe tuberculosis.
Le premier test d’identification après culture repose sur la détection de l’antigène MPT64, protéine incriminée dans la viru-lence et secrétée par les mycobactéries du complexe tuberculosis (excepté quelques souches de BCG dont la souche vaccinale Pas-teur). Cette détection sur kit unitaire est réalisée en 15 minutes à partir de culture en milieu solide ou liquide. La sensibilité et la spécificité sont de l’ordre de 99 %. Ce test permet d’identifier le complexe tuberculosis, hors BCG, dès la positivité de la culture [15].
Le deuxième test par immunochromatographie est réalisé direc-tement sur les urines du patient suspect de tuberculose et repose sur la détection de lipoarabinomannane (LAM), composant majo-ritaire de la paroi bactérienne. Ce test peu couteux, rapide et facile est utilisé dans les pays en voie de développement à forte inci-dence de co-infection tuberculose-VIH où il présente une valeur prédictive positive (VPP) de 80 %. Du fait de sa faible spécificité et d’un faible taux de prévalence, ce test ne peut être utilisé en France [16].
2.4. Identification des mycobactéries par spectrométrie de masse
Ces dernières années, la spectrométrie de masse de type matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) a permis de faciliter et d’accélérer l’identification des espèces bac-tériennes. Cette technique est en cours de développement pour les mycobactéries et permet l’identification du complexe tuber-culosis ainsi que l’identification de la majorité des mycobactéries atypiques à partir des cultures [17,18]. L’identification à partir d’un milieu solide semble supérieure à celle effectuée à partir d’un milieu liquide. Les auteurs observent 97 % d’identification correcte à partir de milieu solide contre 77 % à partir de milieu liquide. Cer-tains composants du milieu liquide interfèreraient sur la qualité des spectres et parfois l’inoculum bactérien serait trop faible [17]. L’innocuité de cette technique a été vérifiée et semblerait être un point important. Les colonies ou la fraction de milieu liquide utili-sées sont prétraitées par choc thermique ou par de l’éthanol [18].
La spectrométrie de masse de type MALDI-TOF a récemment été couplée dans la technologie iPLEX Gold (Sequenom) à une analyse de polymorphismes génétiques permettant à la fois de différen-cier les espèces du complexe tuberculosis mais aussi de renseigner l’appartenance à un groupe phylogénétique à des fins épidémiolo-giques [19].
l’avantage de proposer des concentrations minimales inhibitrices (CMI) permettant d’adapter au mieux le traitement [27].
2.6. Méthodes génotypiques
2.6.1. Historique
Les tests d’amplification génique (appelés NAAT dans la lit-térature anglo-saxonne pour Nucleic Acid Amplification Test) permettent de multiplier artificiellement le nombre de copies d’une séquence d’acides nucléiques spécifique afin d’en permettre la détection. Ces tests sont rapides car ils s’affranchissent du temps de multiplication des mycobactéries du complexe tuberculosis. Aujourd’hui, l’automatisation et la PCR en temps réel ont supplanté les anciennes techniques, mais ces tests de biologie moléculaire doivent toujours être associés à une culture et un antibiogramme par méthode phénotypique.
Les tests d’amplification génique sont caractérisés par leur grande sensibilité. En théorie, ils peuvent détecter une copie d’acide nucléique par échantillon. En réalité la sensibilité est compromise par la présence d’inhibiteurs de l’amplification et la perte d’acides nucléiques lors de la préparation de l’échantillon. La spécificité est élevée et peut être améliorée par l’utilisation de différentes sondes permettant, notamment la détection de mutation conférant la résistance. Leur principal avantage est la rapidité face à la lenteur des méthodes phénotypiques.
2.5. Détermination de la sensibilité aux antituberculeux par méthode phénotypique
Bien que la méthode des proportions en milieu solide demeure la méthode de référence pour la détermination de la sensibilité aux antituberculeux de première intention (rifampicine, isoniazide, éthambutol, streptomycine et pyrazinamide), les antibiogrammes sont désormais le plus souvent réalisés en milieu liquide sur l’automate Bactec MGIT 960 ou VersaTREK. Ces antibiogrammes sont majoritairement effectués à partir d’un premier isolat obtenu en milieu liquide, soit en moyenne deux semaines après la prise en charge initiale du prélèvement. L’intérêt repose sur la diminution significative du délai de rendu du résultat (10 jours en milieu liquide après une première culture, versus 3 à 4 semaines en milieu solide) [20]. Des études montrent que des antibiogrammes sur milieu liquide peuvent être réalisés directement à partir d’échantillons avec examen direct positif permettant ainsi d’optimiser le délai de rendu de résultat [20,21].
Ces antibiogrammes en milieu liquide automatisé sont très per-formants [22], à l’exception toutefois de la détermination de la sensibilité au pyrazinamide, rendue difficile par la nécessité d’un pH acide et d’un inoculum élevé, entraînant souvent une fausse résistance au pyrazinamide [23].
La détermination de la sensibilité aux antituberculeux majeurs peut également être réalisée selon la technique microscopic obser-vation drug susceptibility (MODS) qui repose sur l’observation microscopique quotidienne de BAAR dans des cultures issues d’expectorations en présence ou non d’antituberculeux. Cette tech-nique peu coûteuse est surtout utilisée dans les pays en voie de développement où elle permet de détecter rapidement la présence de souche MDR avec une sensibilité et une spécificité respectives de 100 et 94 % [24].
Bien qu’il n’existe pas de standardisation, la sensibilité des antituberculeux de 2e ligne peut également être testée en milieu liquide à l’aide du Bactec MGIT 960 pour ce qui est de l’amikacine, la capréomycine, l’éthionamide, la kanamycine, l’ofloxacine, la moxifloxacine, le linézolide, l’acide para-amino salicylique et la rifabutine [25,26] ou à l’aide de microplaque Sensititre MYCOTB (Trek Diagnostics) comprenant 8 antibiotiques de 2e intention en plus des antituberculeux majeurs. Cette technique présente
2.6.2. Diagnostic direct par amplification génique
De nombreuses techniques, permettant la détection du complexe tuberculosis à partir d’échantillons biologiques, ont été commercialisées et on fait l’objet de nombreuses publications. Récemment, de nouveaux tests associant à la fois détection des MCT et détection de la résistance à certains antituberculeux ont été développés.
2.6.3. Test d’hybridation inverse sur bandelettes (MTBDR® plus, Hain LifeScience)
Ces tests correspondent à une amplification multiplex d’ADN couplée à une hybridation sur bandelettes et sont utilisées en rou-tine pour l’identification des mycobactéries, mais aussi pour la détection de la résistance aux antituberculeux.
L’identification par amplification et hybridation se fait en quelques heures à partir de culture. Le complexe tuberculosis peut être mis en évidence par le kit GenoType® Mycobacterium CM/AS (Hain LifeScience) dont la technologie cible l’ADNr 23S. L’identification d’espèce au sein du complexe tuberculosis par le test GenoType® MTBC est fondée sur l’analyse du polymorphisme du gène gyrB.
Pour ce qui est de la détection de la résistance aux antibiotiques, le principe repose dans un premier temps sur l’amplification de fractions de gènes codant pour la cible des antituberculeux et dans un deuxième temps sur l’hybridation avec des sondes cor-respondant aux gènes sauvages ou aux gènes mutés présents sur la bandelette. Les kits commercialisés peuvent être utilisés à par-tir de culture ou d’échantillons positifs à l’examen microscopique, voire négatifs. Le clinicien peut rapidement être informé sur la présence de complexe tuberculosis et sur la sensibilité aux deux antituberculeux majeurs (rifampicine et isoniazide). La première génération de test GenoType® MTBDRplus 1.0 permet en quelques heures et en un seul test de détecter le complexe tuberculosis ainsi que le statut de la résistance à la rifampicine et l’isoniazide, soit à partir d’échantillons avec examen direct positif, ou soit à partir de cultures positives. Dans les deux cas, la sensibilité de la détection de la résistance à la rifampicine est de 98 % et à l’isoniazide de 87 % [28,29]. Un screening au niveau d’un fragment de 81 paires de bases (pb) du gène rpoB (rifampicin resistance determinig region RRDR) permet de mettre en évidence tout type de mutation connue ou non par le kit. La résistance de bas et haut niveau à l’isoniazide repose sur la recherche des mutations des gènes inhA et katG. Depuis peu, les prélèvements pulmonaires non bacillifères peuvent être analy-sés par la nouvelle génération de test GenoType® MTBDRplus 2.0. L’étude de Crudu et al. en zone de moyenne endémie montre une sensibilité de 79,8 % pour la détection du complexe tuberculosis ainsi qu’une sensibilité de la détection de la résistance de 90 % pour la rifampicine et de 93,5 % pour l’isoniazide [30].
Dans les pays à forte incidence de tuberculose XDR, le test GenoType® MTBDRsl permet à partir de culture de détecter la résis-tance aux fluoroquinolones, à l’éthambutol, à l’amikacine et à la capréomycine avec une sensibilité variant de 77,3 à 92,3 % [31].
2.6.4. Test Xpert MTB/RIF®
Le test Xpert MTB/RIF® est un test moléculaire unitaire qui per-met la détection dans les prélèvements cliniques des fragments d’ADN du génome des mycobactéries du complexe tuberculosis et leur éventuelle résistance à la rifampicine en deux heures. Il est réalisé sur la plateforme GenXpert® (Cepheid). Ce test automa-tisé semi-quantitatif de PCR en temps réel permet de réaliser, à la demande et dans une seule cartouche, les différentes étapes d’extraction, purification, amplification d’ADN, hybridation des sondes et détection multiplex. L’amplification génique cible la région de 81 pb du gène rpoB, qui code la sous-unité de l’ARN polymérase et qui héberge les principales mutations responsables de la résistance à la rifampicine. Cinq sondes de type « balise molé-culaire » couvrent l’ensemble de cette région et s’hybrident avec les séquences sauvages.
Une étude réalisée sur des dilutions en série de suspensions bac-tériennes préparées à partir de souches de référence du complexe tuberculosis a démontré que la technique Xpert MTB/RIF four-nissait une évaluation rapide et fiable de la charge bactérienne au-dessus d’un seuil de 100 bactéries par échantillon [32]. De ce fait, dans des cas de forte suspicion de tuberculose pulmonaire ou extra-pulmonaire, cette technique permet sur des prélève-ments microscopiques négatifs d’optimiser un diagnostic rapide de tuberculose en moins de 2 heures [33]. Contrairement aux autres techniques de PCR, l’étape de lavage intégrée dans la cartouche du test permet de ne conserver que les organismes intacts sans tou-tefois faire la distinction entre organismes viables et non viables [34]. Les études récentes sur l’évaluation de la performance diag-nostique de ce test ont montré que la sensibilité par rapport à la culture était de plus de 98 % pour les prélèvements à microscopie positive mais de 68 % pour les prélèvements à microscopie négative [35].
Cette technique reste donc moins sensible que la culture et un résultat négatif obtenu sur un prélèvement pauci-bacillaire ne per-met pas d’exclure une tuberculose. Une sélection des patients sur la base de l’analyse de risques pourrait permettre une utilisation rationnelle de ce test.
La résistance à la rifampicine est un bon marqueur prédictif de la multirésistance. Bien que la sensibilité et la spécificité du test Xpert MTB/RIF soient ≥ 98 %, dans nos pays à faible prévalence de souche résistante à la rifampicine, la VPP de la résistance à la rifam-picine de ce test est plus faible et des résistances détectées par erreur peuvent être suspectées [35], nécessitant de réaliser systé-matiquement un antibiogramme. Mais ce test présente l’avantage d’être simple, rapide, sensible et spécifique pour les prélèvements pulmonaires à microscopie positive, permettant ainsi d’accélérer une prise en charge adéquate des patients en termes d’isolement, mais aussi de traitement antituberculeux si le patient présente des facteurs de risques d’avoir été en contact avec une souche multirésistante [36]. Cependant, certains auteurs remettent en question la sensibilité des tests phénotypiques concernant la détec-tion de la résistance à la rifampicine. Certaines mutations du gène rpoB détectées par méthodes génotypiques, mais sans expression
phénotypique, notamment en milieu liquide du fait d’une dimi-nution du fitness bactérien des souches mutées, sembleraient être corrélées à des résistances cliniques. Devant une forte suspicion de souche résistante à la rifampicine, ces mêmes auteurs proposent que les tests génotypiques soient complémentaires aux tests phé-notypiques [37,38].
2.6.5. Tests en développement
L’amplification génique est également utilisée pour la recherche de petits fragments d’ADN mycobactérien dans l’urine (ADN trans-rénal). En cours de développement depuis quelques années mais non encore commercialisée, cette méthode alternative à l’examen microscopique des expectorations permettrait de détecter à la fois les tuberculoses pulmonaires et extra-pulmonaires, notamment chez les enfants ou les patients infectés par le VIH [39].
Translation - English Miranda Gaudette
Translated excerpt from “Les nouveaux outils de diagnostic microbiologique de la tuberculose maladie”
The new tools of microbial diagnosis of tuberculosis
2. Process of Direct Diagnosis in the Laboratory
The treatment of samples for mycobacterial testing always follows the same process in view of a double objective:
• First, to perform a test that allows one to provide a rapid response. The microscopic examination, which looks for acid fast bacillus (AFB), is the most common. In function of the context, other methods could be equally performed;
• Second, by inoculating the specimen into culture, with some prolonged delay before bacterial growth, would raise awareness of the diagnosis, and would isolate the bacteria. It would then be possible to identify it, to measure its susceptibility to antibiotics, and to eventually proceed with epidemiological studies.
The manipulation of mycobacteria, in particular those belonging to Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC), is not without risk to laboratory personnel. The laboratory must be made suitably equipped to the criteria of adequate security. Level 3 containment facilities are advised.
2.1 Microscopic examination
After more than 125 years, the direct microscopic examination remains a very rapid and simple tool to inform us about the presence of AFB in biological samples. In the diagnostic approach of pulmonary tuberculosis associated with clinical radiological or histologic signs, direct microscopic smear examination informs us about the bacillary characteristics and therefore the contagiousness of the patient. In this way, permitting confirmation of the decision to impose patient respiratory isolation and to track down possible contacts.
The key step lies most often on a fluorescent auramine stain, more sensitive than that of Ziehl-Neelsen (reference stain). After being stained with auramine, the reading of the smear involved the use of a mercury lamp microscope. This type of microscope has recently been replaced by the use of LED, which is less costly, more robust, and performs like the original. The AFB appears in the form of fluorescent green on a red background for smears stained with auramine, and pink on a blue background after Ziehl-Neelsen staining.
The microscopic result is a quantitative count of the number of AFB per smear or per field according to the standardization of the Centers for Disease Control (CDC).
The threshold of microscopic detection is on the order of 104 AFB/mL of sample. The sensitivity is variable according to the type of sample: 10-20% for extra-pulmonary samples and 65% for pulmonary samples. Consequently, a negative direct test permits the exclusion of a bacillary case or a very bacillary case, but does not exclude the possibility of a paucibacillary, and therefore potentially contagious, case. A negative microscopic examination does not eliminate a tuberculosis diagnosis. Similarly, it cannot predict the recovery within the scope of the monitoring of anti-tuberculosis treatment.
Three negative microscopic examinations permit the lifting of the respiratory isolation imposed when pulmonary tuberculosis is suspected. This can occur only if there is no clinical or thoracic imagery supporting active pulmonary tuberculosis, there has been no contact with an immuno-compromised person, and there is no suspicion of multi-drug resistant tuberculosis.
Positive microscopic examinations also present some limits. Tuberculosis bacilli and atypical mycobacteria cannot be differentiated. Moreover, we cannot tell whether the bacteria are alive or dead. Positive direct microscopic examination is not a good marker of the efficacy of drug therapy, failure of therapy, or of tuberculosis relapse.
2.2 Culture in solid or liquid media
Although the growth of Mycobacterium tuberculosis complex can be very slow, the diagnosis of tuberculosis and the culture remains integral. Culture remains the most sensitive method if preceded by decontamination- liquefaction step for sample sources from open cavities. This method also permits to isolate the origin, supported by the necessary species identification technique and anti-tuberculosis drug susceptibility tests. The most performed culture method is associated with solid and liquid media. The threshold of detection is 10-102 bacilli/mL of biologic sample. The culture period is a function of the bacterial load and can be correlated to the results of the direct microscopic exam. Cultures in solid media become in positive in 2 to 6 weeks. The majority of liquid media are used with automated incubators that include a growth detection system. At the end of the 1990s, there was expanded use of automated incubator systems. These automated systems (Bactec MGIT960® manufactured by Becton Dickinson, VersaTREK® manufactured by Trek Diagnostics, and BacT/ALERT® manufactured by BioMérieux), have the advantage of significantly reducing the positive culture incubation period to 10-14 days compared to cultures on solid media.
2.3 New antigenic methods by immunochromatography
Two types of immunochromatographic tests exist to detect Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC). After culture, initial identification of the Mycobacterium depends on detecting the MPT64 antigen, the protein responsible for the virulence of the bacterium. This protein is secreted by the Mycobacterium tuberculosis complex (except for certain strains of Pasteur's BCG.) This detection by a combined kit is done in 15 minutes from solid or liquid media culture. The sensitivity and specificity are in the range of 99%. This test allows for the identification of Mycobacterium tuberculosis complex, not including BCG, from the AFB positive culture.
The second test by immunochromatography is done directly on the suspect TB patient’s urine and rests on the detection of lipoarabinomannan (LAM), a major component of the MTBC bacterial wall. This test costs little, is rapid, and easy to use in developing countries that have strong incidence of tuberculosis-HIV coinfection, where it presents a positive predictive value of 80%. Owing to its low specificity and low rate of prevalence, this test cannot be used in France.
2.4 Identification of mycobacteria by Mass Spectrometry
Recently over the past few years, a type of mass spectrometry called matrix-assisted laser desorption ionization- time of flight (MALDI-TOF) allows the facilitation and the acceleration of bacterial identification. This technique is still in development for mycobacteria and allows the identification of MTBC as well as the identification of the majority of atypical mycobacteria from cultures. The identification from solid media cultures seem superior to that performed from liquid media. The authors observed 97% of correct identifications from solid media versus 77% from liquid media. Certain components of liquid media interfere with the quality of the spectrum and sometimes the bacterial inoculum can be too weak. The safety of this technique has been verified and appears to be an essential point. The colonies or the portion of liquid media used are pretreated by thermic shock or by ethanol.
MALDI-TOF has recently been paired with the technology iPlex Gold (Sequenom) to an analysis of genetic polymorphisms. This permits, all at once, to differentiate the species of the MTBC, as well as to determine what phylogenetic group the bacteria belongs to for the purposes of epidemiology.
2.5 Determination of the susceptibility to anti-tuberculosis drugs by phenotypic method
Although the proportion method in solid media remains the reference method for the determination of the susceptibility to the first line anti-tuberculosis drugs (rifampicin, isoniazid, ethambutol, streptomycin, and pyrazinamide), drug susceptibilities are more often performed on liquid media using the automated instruments Bactec MGIT 960 or Versatrek. These susceptibilities on the first positive isolate in liquid media sample obtained, should take 2 weeks on average after initial inoculation of the sample. The advantage rests on the significant reduction in delay of result return (10 days in liquid media after the first positive culture, versus 3 to 4 weeks in solid media). From studies showing that susceptibilities on liquid media can be done directly from samples with direct positive tests allowing to minimize the delay before results can be reported.
These susceptibilities in liquid media using automation are very reliable, with exception of, however, the susceptibility of pyrazinamide, made difficult by the necessity of acid pH and a high inoculum, which often leads to a false resistance to pyrazinamide.
The determination of the susceptibility to the major anti-tuberculosis drugs can equally be performed according to the microscopic observation drug susceptibility (MODS) technique, which rests on the daily microscopic observation of AFB in cultures from expectorations in the presence of anti-tuberculosis agents. This technique costs little and especially used in developing countries where this technique permits the rapid detection of the presence of multi-drug resistant strains with a susceptibility and a specificity of 100% and 94% respectively.
Even though standardization does not exist, the susceptibility of second line anti-tuberculosis drugs can equally be tested in liquid media with the aid of the Bactec MGIT 960 as far as capreomycin, ethionamide, kanamycin, ofloxacin, moxifloxacin, linezolid, para-amino salicylic acid, and rifabutin, where the aid of microplate sensititre MYCOTB (TrekDiagnostics) consisting of 8 second-line antibiotics in addition to the first line antibiotics. This technique presents the advantage of proposing minimum inhibiting concentrations (MIC) permitting better adapted patient treatment.
2.6 Genotypic Methods
2.6.1 History
Genetic amplification tests (called NAAT: Nucleic Acid Amplification Test) permit the artificial multiplication of a great number of copies from one sequence of specific nucleic acids in order to allow for detection. These tests are rapid because they reduce the delays in propagation times of Mycobacterium tuberculosis complex. Today, automation and Real Time PCR have supplanted older techniques, but these tests must always be associated with a culture and phenotypic susceptibility testing.
Genetic amplification tests are characterized by their greater sensitivity. In theory, genetic amplification tests can amplify and detect Mycobacterium tuberculosis complex in a sample that has just one copy of nucleic acid. In reality, the sensitivity is compromised by the presence of inhibitors of amplification and the loss of nucleic acids during sample preparation. The specificity is elevated and could improve by utilizing different probes, permitting the detection of mutations conferring resistance. Their principle advantage is quick turnaround time, in contrast to the slower turnaround time of phenotypic methods.
2.6.2 Direct Diagnosis by Genetic Amplification
Numerous techniques that allow for the detection of MTB from biological samples, have been marketed and are the subject of numerous publications. Recently, new tests that combine one step detection of MTBC and detection of resistance to certain anti-tuberculosis drugs have been developed.
2.6.3 Inverse hybridization test on strips (MTB DR® Plus, Hain Life Sciences)
These tests correspond to a multiplex amplification of DNA coupled to a hybridization on strips and are utilized routinely to identify mycobacteria, but are also used for the detection of resistance to anti-tuberculosis drugs.
Identification by amplification and hybridization is done in a few hours from culture. The MTBC can be highlighted by the Genotype Mycobacterium CM/AS kit (Hain Life Sciences) whose technology targets rDNA 23S. Species identification of MTBC by the Genotype MTBC test is based on the analysis of the polymorphism of the gene gyrB.
Regarding the resistance to antibiotics, this principally rests on the amplification of gene fractions coding for the target of the anti-tuberculosis drugs, and also on the hybridization with the probes corresponding to the wild type genes or mutated genes presented on the strip. The commercial kits can be used on cultures or samples with positive or negative smears. The clinician can be rapidly informed of the presence of MTBC and on the susceptibility to it of two major anti-tuberculosis drugs (rifampicin and isoniazid). The first-generation GenoType® MTBDRplus 1.0 test allows in a few hours, and in one test, to detect MTBC and even the resistance to rifampicin and isoniazid, from AFB positive cultures. In the second case, the sensitivity of the detection of the resistance to rifampicin is 98% and for isoniazid, 87%. A screening, at the fragment level of 81 base pairs (bp) of the gene rpoB (the rifampicin resistance determining region RRDR) allows to investigate all known types of mutations by the kit. The low and high level of resistance to isoniazid rests on the test of mutations of the genes inhA and katG. Only recently, the non-bacillary pulmonary samples can be analyzed by the new generation GenoType® MTBDRplus 2.0. The study of Crudu et al. in areas of average endemic disease shows a sensitivity of 79.8% for the detection of MTBC, as well as a sensitivity to rifampicin resistance of 90%, and 93.5% for isoniazid.
In countries with a strong incidence of extreme drug resistance, the GenoType® MTBDRsl allows the detection of resistance to fluoroquinolones, ethambutol, amikacin, and capreomycin from cultures with a sensitivity ranging from 77.3 to 92.3%.
2.6.4 Xpert MTB/RIF® Test
The Xpert MTB/RIF® Test is a combined molecular test that allows for detection of mycobacterial DNA fragments of the MTBC genome in clinical samples, and also their possible resistance to rifampicin in two hours. It is achieved through use of use of the GenXpert (Cepheid) platform. This automated semi-quantitative real time PCR test allow us to achieve, upon request and with one cartridge, the different stages of extraction, purification, DNA amplification, hybridization of probes, and multiplex detection. The genetic amplification of target region 81bp of the gene rpoB, that codes for sub-unit β of RNA polymerase and that accommodates the principle mutations responsible for the resistance to rifampicin. Five probes of the “molecular beacon” type covers both this region and hybridizes itself with the wild sequences.
A study performed on the serial dilutions of prepared bacterial suspensions from reference strains of MTBC have demonstrated that the Xpert MTB/RIF® technique provided a rapid and reliable assessment of a bacterial load over a threshold of 100 bacteria per sample. Consequently, in the strong suspicion of pulmonary or extra-pulmonary tuberculosis, the technique allows for a rapid diagnosis on samples with negative microscopic smears in less than two hours. Contrary to other PCR techniques, the integrated wash step in the test cartridge allows the conservation of intact organisms only, without however, making the distinction between living organisms and non-living organisms. Recent studies on the evaluation of diagnostic performance of this test have shown that the sensitivity in relation to the culture was more than 98% for positive microscopic smear samples, but 68% for negative smear samples.
This technique therefore remains less sensitive and a negative result obtained on a sample with few bacilli cannot rule out tuberculosis. A selection of patients based on risk analysis could allow for rational use of this test.
The resistance to rifampicin is a good predictive marker of multi-resistance. Although sensitivity and specificity of the Xpert MTB/RIF® would be ≥ 98%, in our country with weak prevalence of strains resistant to rifampicin, the positive predictive value (PPV) of rifampicin resistance of this test is weaker, and the resistance detected by error can be suspected, necessitating the automatic performance of susceptibility testing. This test presents the advantage of being simple, rapid, and sensitive and specific for pulmonary samples with a positive microscopic smear, therefore allowing to accelerate adequate patient management in terms of isolation, but also anti-tuberculosis treatment if the patients present with risk factors of having been in contact with a multi-resistant strain. However, certain authors challenge the sensitivity of phenotypic tests concerning the detection of rifampicin resistance. Certain rpoB gene mutations detected by genotypic methods, but without phenotypic expression, notably in liquid media owing to a reduction of bacterial fitness of mutated strains, seeming to be correlated to clinical resistance. In the face of a strong suspicion of rifampicin resistant strains, these authors propose that genetic tests would be complementary to phenotypic tests.
2.6.5 Tests in Development
Genetic amplification is equally utilized for the research of small fragments of mycobacterial DNA in urine (trans-renal DNA). In the process of development for some years, but still not commercialized, this alternative method to microscopic examinations of expectorations allows for the detection of pulmonary and extra-pulmonary tuberculosis infections at the same time, notably in children or patients infected with HIV.
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Translation education
Master's degree - New York University
Experience
Years of experience: 7. Registered at ProZ.com: Dec 2016.
I have completed Master of Science in Translation degree at New York University with a French to English concentration. I previously worked as medical laboratory scientist in both hospitals and a state public health lab, with 12 years of experience. I maintain ASCP (American Society of Clinical Pathologists) certification in medical laboratory science. I'm interested in combining my medical science knowledge with my translation skills. I'm open to other kinds of translation as well. I have previous experience translating French medical journals for publication and medical records.
Keywords: Board-Certified Medical Laboratory Scientist, Masters in Translation
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